ΩRNA 및 표적 DNA와 복합체를 이루는 OMEGA 니카제 IsrB의 구조

May 06, 2023

Nature 610권, 575~581페이지(2022)이 기사 인용

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CRISPR-Cas와 같은 RNA 유도 시스템은 프로그래밍 가능한 기질 인식과 효소 기능을 결합하며, 이 조합은 강력한 분자 기술을 개발하는 데 유리하게 사용되었습니다1,2. 이러한 시스템에 대한 구조적 연구는 RNA와 단백질이 어떻게 기질을 공동으로 인식하고 절단하는지 밝혀내며, 추가 기술 개발을 위한 합리적인 엔지니어링을 안내합니다3. 최근 연구에서는 Cas9의 조상일 가능성이 있는 IscB와 HNH 뉴클레아제 도메인이 결여된 IscB의 상동체인 닉카제 IsrB를 포함하는 OMEGA라고 불리는 새로운 유형의 RNA 유도 시스템이 확인되었습니다4. IsrB는 약 350개의 아미노산으로 구성되어 있지만 상대적으로 큰 RNA 가이드(대략 300-nt ΩRNA)에 의해 작은 크기가 균형을 이루고 있습니다. 여기에서 우리는 동족 ΩRNA 및 표적 DNA와 복합체를 이루는 Desulfovirgula thermocuniculi IsrB(DtIsrB)의 극저온 전자 현미경 구조를 보고합니다. 우리는 IsrB 단백질의 전체 구조가 Cas9와 공통 비계를 공유한다는 것을 발견했습니다. 그러나 표적 선택을 용이하게 하기 위해 인식(REC) 엽을 사용하는 Cas9와 달리 IsrB는 ΩRNA에 의존하며 그 일부는 REC와 유사하게 위치하는 복잡한 삼원 구조를 형성합니다. IsrB 및 해당 ΩRNA의 구조 분석과 다른 RNA 유도 시스템과의 비교는 단백질과 RNA 간의 기능적 상호 작용을 강조하여 이러한 다양한 시스템의 생물학과 진화에 대한 이해를 향상시킵니다.

RNA 유도 IsrB 단백질은 IS200/IS605 트랜스포존 슈퍼패밀리에 인코딩된 OMEGA 계열 구성원입니다. IsrB는 계통발생 분석과 공유된 고유 도메인 구조4,5에서 알 수 있듯이 Cas9의 명백한 조상인 또 다른 OMEGA 계열 구성원인 IscB의 전조일 가능성이 높습니다. IscB 및 Cas9와 마찬가지로 IsrB에는 브리지 나선(BH) 삽입에 의해 중단되는 RuvC 유사 뉴클레아제 도메인이 포함되어 있습니다(그림 1a). 그러나 IscB 및 Cas9와 달리 IsrB에는 HNH 뉴클레아제 도메인, REC 로브 및 프로토스페이서 인접 모티프(PAM-) 상호작용 도메인의 상당 부분이 부족하므로 Cas9보다 훨씬 작습니다(대략 350개 아미노산). . IsrB는 N 말단 PLMP 도메인(보존된 아미노산 모티프의 이름을 따서 명명)과 특성화되지 않은 C 말단 도메인(그림 1b)을 추가로 포함합니다. 이전 연구에서는 IsrB가 대략 300-nt ΩRNA와 결합하여 IsrB가 5'-NTGA-3' 표적 인접 모티프(TAM)를 포함하는 이중 가닥(ds) DNA의 비표적 가닥에 흠집을 내도록 유도하는 것으로 나타났습니다. .

a, IsrB(왼쪽) 및 Cas9(오른쪽)에 대한 유전자좌 아키텍처 및 가이드 RNA. b, Streptococcus pyogenes SpCas9(상단) 및 D. thermocuniculi IsrB(DtIsrB)(하단)의 도메인 아키텍처. c, ΩRNA 및 표적 DNA와 복합체를 이루는 IsrB의 도식. 구조 연구에 사용된 TAM 및 표적 서열을 포함하는 부분 DNA 이중체는 서열 문자로 표시됩니다. d, e, IsrB-ΩRNA 표적 DNA 복합체의 Cryo-EM 밀도 맵(d) 및 구조 모델(e). 점선은 ΩRNA의 제대로 분해되지 않은 영역을 나타냅니다. TE, 트랜스포존 말단; DR, 직접 반복; NUC, 뉴클레아제; PI, PAM 상호작용; PLL, 인산염 잠금 루프; TI, TAM 상호작용; TS, 표적 가닥; NTS, 비표적 가닥.

IsrB에 의한 ΩRNA 유도 DNA 표적화의 분자 메커니즘을 특성화하기 위해 우리는 Desulfovirgula thermocuniculi IsrB(DtIsrB), 20nt 가이드 세그먼트, 31nt 표적 DNA 가닥 및 10 - 단일 입자 저온 EM을 사용하는 nt 비표적 DNA 가닥(그림 1c). 우리는 3.1Å의 전체 해상도로 삼원 복합체의 3차원(3D) 재구성을 얻었습니다(그림 1d, 확장 데이터 그림 1a-c 및 확장 데이터 표 1). 그러나 ΩRNA에 해당하는 지도의 일부 영역은 낮은 해상도에서 확인되었습니다. RNA 좌표의 모델링을 개선하기 위해 우리는 공분산 기반 2차 구조 모델과 함께 RNA 특정 모델링 도구인 auto-DRRAFTER를 사용하여 초기 ΩRNA 모델을 구축했습니다. 이 ΩRNA 모델과 단백질 구조 예측에 의해 생성된 초기 IsrB 모델을 기반으로 우리는 IsrB-ΩRNA-DNA 구조를 결정했습니다(그림 1e 및 확장 데이터 그림 1d,e 및 2)6,7,8.